Jun-ichi Kadokawa
Cet article présente une étude de la phosphorolyse enzymatique de substrats oligo-d-glucosaminide liés à α(1→4) par catalyse par l'α-glucane phosphorylase thermostable (de Aquifex aeolicus VF5). L'α-glucane phosphorylase catalyse à la fois la phosphorolyse et la glucosylation/polymérisation à l'extrémité non réductrice des substrats de glucose liés à α(1→4) en fonction des conditions. Les auteurs ont également découvert que le polymère d-glucosaminide lié à α(1→4) (stéréoisomère de chitosane) était obtenu par la polymérisation enzymatique catalysée par l'α-glucane phosphorylase thermostable de l'α-d-glucosamine 1-phosphate à partir d'un préliminaire de maltooligosaccharide. Dans l'étude actuelle, nous espérons découvrir si le composé catalyse la phosphorolyse de substrats contenant de telles chaînes d-glucosaminide. Les substrats oligo-d-glucosaminide liés à l'α(1→4)- dérivés du maltotriose ont d'abord été arrangés par la polymérisation enzymatique catalysée par l'α-glucane phosphorylase thermostable de l'α-d-glucosamine 1-phosphate à partir du maltotriose préliminaire et le nettoyage résultant par HPLC préparatif. La phosphorolyse des substrats suivants est dirigée sous l'action de l'α-glucane phosphorylase thermostable dans un coussin de phosphate. Les résultats explicatifs des articles ont complètement confirmé l'événement de phosphorolyse à l'extrémité non réductrice des deux chaînes de successions d-glucosamine-α(1→4)- d-glucosamine et d-glucosamine-α(1→4)- d-glucose. La polymérisation enzymatique a été identifiée comme un moyen incroyable de traiter la polymérisation intégrée composée de systèmes sonores et de liaisons glycosidiques régio-contrôlées [1-6]. L'α-glucane phosphorylase est l'un des produits chimiques qui ont pratiquement été utilisés comme impulsion pour la polymérisation enzymatique pour créer des polysaccharides bien caractérisés. L'α-glucane phosphorylase catalyse la phosphorolyse in vivo des α(1→4)-glucanes, par exemple l'amylose et le glycogène à l'extrémité non réductrice en vue du phosphate inorganique (Pi) pour produire l'α-D-glucose 1-phosphate (Glc-1-P). En raison de la réversibilité de cette réponse phosphorolytique, ce catalyseur catalyse également la glucosylation in vitro de l'α(1→4)-glucane en tant qu'accepteur de glycosyle, par exemple, le maltooligosaccharide en utilisant Glc-1-P en tant que donneur de glycosyle pour créer une liaison glucosidique α(1→4) avec libération de Pi. La réponse réversible par catalyse par l'α-glucane phosphorylase se résume comme suit : [α(1→4)-Glc]n+1+Pi → [α(1→4)-Glc]n+Glc-1-P. Dans les conditions de rapport donneur/accepteur énorme, les glucosylations progressives à l'extrémité non réductrice allongée du maltooligosaccharide comme substrat se produisent par catalyse de l'α-glucane phosphorylase, ce qui incite la polymérisation enzymatique à produire un polysaccharide lié (1→4), c'est-à-dire l'amylose. Le niveau de polymérisation (DP) de l'amylose peut être limité par le rapport donneur/accepteur. Les α-glucane phosphorylases ont montré la particularité diverse pour la reconnaissance des substrats, en fonction de leurs sources.Par exemple, les plus petits substrats détectés par l'α-glucane phosphorylase la plus largement reconnue (α-glucane phosphorylase de pomme de terre) dans les réponses de phosphorolyse et de glucosylation sont normalement le maltopentaose (Glc5) et le maltotétraose (Glc4), séparément. En revanche, Glc4 et le maltotriose (Glc3) sont les plus petits substrats détectés par l'α-glucane phosphorylase séparée des sources bactériennes thermophiles (α-glucane phosphorylase thermostable) dans les réponses de phosphorolyse et de glucosylation, individuellement. En outre, les α-glucane phosphorylases sont connues pour montrer une faible spécificité pour la reconnaissance des substrats, qui a également été considérée comme dépendante de leurs sources. L'α-glucane phosphorylase de pomme de terre catalyse les glucosaminylations enzymatiques en utilisant l'α-D-glucosamine 1-phosphate (GlcN-1-P) et son subordonné, le N-formyl-α-D-glucosamine 1-phosphate (GlcNF-1-P), comme bienfaiteurs glycosyliques non locaux dans le berceau de dérivation d'acide acétique pour fournir des oligosaccharides ayant une unité GlcN(F) à l'extrémité non réductrice, tandis que les glucosaminylations progressives utilisant GlcN-1-P se produisent par catalyse d'α-glucane phosphorylase thermostable (de Aquifex aeolicus VF5) dans le support de dérivation d'acide acétique, offrant une montée aux chaînes oligo-GlcN connectées en α(1→4) à l'extrémité non réductrice des accepteurs glycosyliques, par exemple, Glc3, le plus petit accepteur glycosylique pour ce catalyseur. Malgré l'augmentation du rapport entre le bienfaiteur et l'accepteur, les estimations DP des chaînes α(1→4)-GlcN sont restées en tout et pour tout cinq. Ce résultat a démontré que l'allongement supplémentaire de la chaîne était empêché par le Pi produit à partir de GlcN-1-P, car il s'agit d'un substrat local pour la phosphorolyse par catalyse par l'α-glucane phosphorylase. Une tentative a ensuite été faite pour éliminer le Pi comme accélérateur du champ de glucosaminylation enzymatique en exécutant la réaction dans un support d'ammonium (0,5 M, pH 8,5) contenant du MgCl2, étant donné que la distribution précédente a montré que le Pi forme un sel insoluble avec des particules d'ammonium et de magnésium. Ainsi, les glucosaminylations enzymatiques progressives ont été accélérées dans la structure du berceau pour provoquer la polymérisation de GlcN-1-P à partir de la base Glc3, donnant accès au polymère D-glucosaminide lié à α(1→4), qui ressemble à la structure d'un stéréoisomère de chitosane]. Sur la base des résultats ci-dessus, nous avons supposé que l'α-glucane phosphorylase thermostable catalyse la glucosaminylation utilisant GlcN-1-P, mais aussi la phosphorolyse à l'extrémité non réductrice de la chaîne glucosaminide liée à α(1→4), en fonction de la concentration de Pi. En outre, il a été constaté que l'α-glucane phosphorylase thermostable (d'Escherichia coli) présentait des pratiques synergétiques distinctes envers la phosphorolyse et la glucosylation en fonction des conditions de réponse. Dans le présent article,nous rapportons l'examen exact pour découvrir si l'α-glucane phosphorylase thermostable catalyse la phosphorolyse des substrats oligo-D-glucosaminides-maltotriose (GlcNm-Glc3) connectés en α(1→4). Nous avons initialement organisé les substrats oligo-D-glucosaminidesmaltotriose connectés en α(1→4) pour la phosphorolyse, c'est-à-dire les tétrahexasaccharides (GlcN-Glc3, GlcN2-Glc3 et GlcN3-Glc3) par la polymérisation enzymatique catalysée par la phosphorylase thermostable de GlcN-1-P comme indiqué par la procédure d'écriture. Le plus petit substrat, Glc3, a été utilisé comme introduction pour la polymérisation pour éviter le cas de phosphorolyse du substrat, étant donné que le composé ne catalyse pas sa phosphorolyse. Français La réponse a été agi dans la proportion d'alimentation GlcN-1-P/Glc3 de 10:1 sous l'effet de l'α-glucane phosphorylase thermostable dans un berceau alcalin (pH 8,5) contenant des particules de Mg2+ à 40°C pendant 48 h. Le temps de réponse plus court a été utilisé dans cette étude que la condition d'écriture (7 jours) pour administrer GlcNm-Glc3 avec de faibles valeurs DP. Le MALDI-TOF MS de l'article brut après traitement GA observe quelques sommets concernant les masses subatomiques d'oligosaccharides contenant une à cinq unités GlcN, favorisant la création du GlcNm-Glc3 plus court que les articles d'écriture (m=~ 12). De plus, le résultat de la spectrométrie de masse MALDI-TOF ne montre en outre aucun événement d'hydrolyse de type exo au niveau de la section Glc3 dans les oligosaccharides produits par catalyse GA, ce qui suggère la proximité des chaînes GlcN à l'extrémité non réductrice de Glc3. Le chromatogramme HPLC après équilibrage du produit avec de l'acide chlorhydrique montre les sommets pluriels relatifs aux oligosaccharides avec différents DP. Comme il se doit, les parties d'un sommet A relatives à un tétrasaccharide et les sommets B et C relatives aux penta- et hexasaccharides ont été rassemblées par HPLC préparative. La spectrométrie de masse MALDI-TOF des parties précédentes et dernières montre des sommets relatifs aux masses atomiques de GlcN-Glc3 et GlcN2-Glc3/GlcN3-Glc3, individuellement, démontrant que le tétrasaccharide et un mélange des penta- et hexasaccharides ont été efficacement séparés.Le MALDI-TOF MS de l'élément brut après traitement GA montre quelques sommets relatifs aux masses subatomiques d'oligosaccharides contenant 1 à 5 unités GlcN, ce qui soutient la création du GlcNm-Glc3 plus court que les éléments d'écriture (m = ~ 12). De plus, le résultat MALDI-TOF MS ne montre également aucun événement d'hydrolyse de type exo au niveau de la section Glc3 dans les oligosaccharides créés par catalyse GA, suggérant la proximité des chaînes GlcN à l'extrémité non réductrice de Glc3. Le chromatogramme HPLC après équilibrage de l'élément avec de l'acide chlorhydrique montre plusieurs sommets relatifs aux oligosaccharides avec différents DP. Comme il se doit, les parties d'un sommet A relatives à un tétrasaccharide et les sommets B et C relatives aux penta et hexasaccharides ont été recueillies par HPLC préparative. Le MALDI-TOF MS des parties précédentes et dernières montre des sommets relatifs aux masses atomiques de GlcN-Glc3 et GlcN2-Glc3/GlcN3-Glc3, individuellement, démontrant que le tétrasaccharide et un mélange de penta- et hexasaccharides ont été efficacement séparés.Le MALDI-TOF MS de l'élément brut après traitement GA montre quelques sommets relatifs aux masses subatomiques d'oligosaccharides contenant 1 à 5 unités GlcN, ce qui soutient la création du GlcNm-Glc3 plus court que les éléments d'écriture (m = ~ 12). De plus, le résultat MALDI-TOF MS ne montre également aucun événement d'hydrolyse de type exo au niveau de la section Glc3 dans les oligosaccharides créés par catalyse GA, suggérant la proximité des chaînes GlcN à l'extrémité non réductrice de Glc3. Le chromatogramme HPLC après équilibrage de l'élément avec de l'acide chlorhydrique montre plusieurs sommets relatifs aux oligosaccharides avec différents DP. Comme il se doit, les parties d'un sommet A relatives à un tétrasaccharide et les sommets B et C relatives aux penta et hexasaccharides ont été recueillies par HPLC préparative. Le MALDI-TOF MS des parties précédentes et dernières montre des sommets relatifs aux masses atomiques de GlcN-Glc3 et GlcN2-Glc3/GlcN3-Glc3, individuellement, démontrant que le tétrasaccharide et un mélange de penta- et hexasaccharides ont été efficacement séparés.
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