Guido Krupp
Résumé La disponibilité d'ARNm synthétiques de haute qualité (ARNm-syn) a permis des progrès dans leurs applications. L'intérêt croissant des investisseurs privés et des grandes sociétés pharmaceutiques a donné naissance à une nouvelle activité de plusieurs milliards de dollars. Il s'agit d'une situation rare dans laquelle deux entreprises allemandes figurent parmi les trois principaux acteurs du secteur. Amptec reconnaît son obligation de soutenir les nouveaux acteurs en fournissant des produits d'ARNm personnalisés et de haute qualité. Les exigences dans l'application de la manipulation cellulaire médiée par l'ARNm étaient (i) l'expression d'antigènes dans les cellules dendritiques pour la vaccination dans l'oncogenèse, les maladies infectieuses et la prévention des allergies ; (ii) la reprogrammation des fibroblastes en cellules souches pluripotentes induites avec différenciation ultérieure vers le type de cellule souhaité ; (iii) les applications en thérapie génique. Un aperçu récent présente les applications et les exigences de qualité correspondantes de l'ARNm-syn. Les ARNm-syn peuvent être générés par transcription in vitro (IVT) à partir de modèles contenant le gène synthétique. En principe, des plasmides linéarisés peuvent être utilisés comme modèles. Cependant, cette procédure est entravée par plusieurs inconvénients tels qu'un clivage plasmidique incomplet entraînant une mauvaise reproductibilité ; et de grandes quantités d'ADN plasmidique introduisant des composants bactériens indésirables avec des complications possibles des applications in vivo. De plus, l'activité optimale de l'ARNm dépend d'une queue poly (A) très longue et non masquée, idéalement longue de 120 nucléotides. Mais les longues répétitions homopolymériques sont instables dans les cellules bactériennes. Nous avons développé une procédure alternative, avec des produits PCR bien définis comme modèles IVT. Cette approche et les exigences de qualité détaillées pour les ARNm synthétiques sont présentées. Les problèmes observés dans la synthèse d'ARNm basée sur l'IVT sont présentés, combinés avec des solutions de problèmes. Compte tenu des nucléases conçues ou bactériennes, l'amélioration des avancées en matière de modification du génome a ouvert la possibilité de cibler et d'ajuster légitimement les successions génomiques dans pratiquement toutes les cellules eucaryotes. La modification du génome a étendu notre capacité à expliquer l'engagement des qualités héréditaires dans la maladie en faisant progresser la création de modèles cellulaires et animaux de plus en plus précis de procédures névrotiques et a commencé à montrer un potentiel exceptionnel dans un assortiment de domaines, allant de la recherche fondamentale à la biotechnologie appliquée et à la recherche biomédicale. Les progrès continus dans la création de nucléases programmables, telles que les nucléases à doigts de zinc (ZFN), les nucléases effectrices de type activateur d'interprétation (TALEN) et les nucléases CRISPR (Case-related nucleases) ont considérablement accéléré le passage de la modification de la qualité de l'idée à la pratique clinique. Nous examinons ici les progrès en cours des trois principales avancées en matière de modification du génome (ZFN, TALEN et CRISPR/Cas9) et discutons des utilisations de leurs réactifs subsidiaires comme outils de modification de la qualité dans différentes maladies humaines et de futurs traitements potentiels, en nous concentrant sur les cellules eucaryotes et les modèles animaux. Enfin,Nous présentons un schéma des préliminaires cliniques appliquant les étapes de modification du génome pour le traitement des maladies et certaines des difficultés rencontrées dans la mise en œuvre de cette innovation. Au cours des dernières années, le développement fulgurant de la modification du génome a modifié la recherche sur le génome humain, ce qui a permis aux chercheurs de mieux comprendre le lien entre un seul élément génétique et une maladie chez un être vivant. Au cours des années 1970, l'amélioration de la conception génétique (contrôle de l'ADN ou de l'ARN) a créé une nouvelle frontière dans l'édition du génome.1 Basées sur des nucléases artificielles ou bactériennes, les avancées en matière de modification du génome ont été réalisées à un rythme rapide au cours des dernières années et ont commencé à montrer une utilité inhabituelle dans divers domaines, allant de la recherche fondamentale à la biotechnologie appliquée et à la recherche biomédicale.2 La modification du génome peut être réalisée in vitro ou in vivo en amenant le matériel de modification in situ, qui inclut, supprime et « modifie » efficacement les gènes tout comme effectue d'autres modifications génomiques hautement ciblées.3,4 Les modifications ciblées de l'ADN commencent par l'apparition de cassures doubles abandonnées (DSB) activées par la nucléase, ce qui conduit à l'incitation de composants de recombinaison hautement efficaces de l'ADN cellulaire dans les cellules de mammifères.5,6 Les DSB d'ADN induits par la nucléase peuvent être corrigés par l'un des deux principaux instruments qui se produisent dans pratiquement tous les types de téléphones et d'animaux : la réparation coordonnée par homologie (HDR) et la jonction d'extrémité non homologue (NHEJ),7 se produisant dans des incorporations ciblées ou des interruptions de séquence, séparément. En fait, la recombinaison homologue (HR), dans laquelle des fragments d'ADN homologues intacts sont utilisés comme séquences, a été le moyen de traiter la reconnaissance ciblée par extension, substitution ou inactivation de séquences ; cependant, l'utilisation de la HR est fortement limitée en raison de son gaspillage dans les cellules de mammifères et les organismes modèles.8 Après avoir découvert que les DSB pouvaient augmenter la fréquence de HDR de plusieurs degrés significatifs, les nucléases dirigées ont été découvertes comme un moyen alternatif de traiter pour augmenter l'efficacité de la modification génétique intervenue par HDR. Lorsqu'une DSB ciblée a été créée, la HDR peut recréer l'ADN coupé en utilisant un modèle d'ADN exogène simple pour le groupement du site de rupture. Ce composant peut être utilisé pour produire des modifications exactes en apportant un modèle de réparation correctement structuré directement dans les cellules ciblées,9,10 ainsi, de manière explicite au site, provoquant une modification de transformation ou une nouvelle inclusion de succession. D'autre part, la réparation intervenue par NHEJ entraînera généralement des erreurs car elle conduit à une organisation efficace d'inclusions ou d'effacements de gènes (indels) dans différentes longueurs au niveau du site DSB, ce qui entraîne à terme une inactivation de la protéine.11 Si des indels se produisent dans le groupement codant, il y aura des transformations de décalage de cadre, qui entraîneront une corruption de l'ARNm ou une création de protéines raccourcies non fonctionnelles par une dégradation intercalée de babble.12 Cette méthodologie et ses applications sont considérées comme plus simples que les techniques basées sur la HR dans la mesure où (a) il n'y a pas besoin d'un réseau fixe et (b) le type de cellule a moins d'effet sur l'adéquation de la modification (malgré la HR, la NHEJ peut être dynamique tout au long du cycle cellulaire).13 Ainsi, comme l'ARNi, la NHEJ pourrait être utilisée dans les lignées cellulaires déifiées pour induire l'inactivation d'une seule ou de plusieurs cellules, mais en effectuant des changements sans interruption, elle pourrait conduire à une inactivation durable de la cellule.9 Dans la phase de développement précoce de la modification du génome, pour initier les DSB idéaux sur chaque site cible spécifique de l'ADN, la création de nucléases à doigts de zinc (ZFN)14 ou de méganucléases15 distinctes a été le centre de recherche. Ces structures de nucléases nécessitaient une capacité particulière à créer de fausses protéines comprenant des espaces de restriction d'ADN spécifiques à arrangement réglable, chacun associé à une nucléase vague pour le clivage de la cible, fournissant aux scientifiques des instruments phénoménaux pour effectuer des manipulations génétiques.16 Par la suite, une autre classe d'un domaine réactif de Flavobacterium okeanokoites (FokI) obtenu à partir de protéines bactériennes appelée effecteurs de type activateur de traduction (TALE) a révélé des perspectives supplémentaires pour l'édition précise du génome.17 Les nucléases programmables basées sur TALE peuvent couper n'importe quel groupement d'ADN d'enthousiasme avec une fréquence modérément élevée. Cependant, les difficultés fondamentales des approches de nucléases effectrices de type activateur de traduction (TALEN) sont la conception d'un clonage atomique complexe pour chaque nouvelle cible d'ADN et sa faible productivité de criblage du génome dans des cellules efficacement ciblées. Biographie Guido Krupp est le PDG et président d'Amptec GmbH. Il a obtenu son doctorat de l'Université de Würzburg et de l'Institut Max-Planck, Martinsried. Il a fait son postdoctorat à l'université de Yale. Il est nommé chef de groupe de recherche à l'université de Kiel. Il est le fondateur d'Artus GmbH et d'Amptec GmbH. Ses intérêts de recherche comprennent la technologie des acides nucléiques en mettant l'accent sur l'ARN, les agents pathogènes des plantes (viroïdes), les ribozymes et la télomérase. Il a publié plus de 60 publications et a été nommé rédacteur en chef de Ribozyme Biochemistry & Biotechnology et de Telomeres, Telomerases & Cancer, et membre du comité de rédaction de Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.com9 Dans la phase de développement précoce de la modification du génome, pour initier les DSB idéaux à chaque site cible spécifique de l'ADN, la création de nucléases à doigts de zinc (ZFN)14 ou méganucléases15 distinctes a été le centre de recherche. Ces structures de nucléases nécessitaient une capacité particulière à créer de fausses protéines constituées d'espaces de restriction d'ADN spécifiques à arrangement variable, chacun associé à une nucléase spécifique pour le clivage de la cible, fournissant aux scientifiques des instruments phénoménaux pour effectuer des manipulations génétiques.16 Par la suite, une autre classe de zone réactive de Flavobacterium okeanokoites (FokI) obtenue à partir de protéines bactériennes appelée effecteurs de type activateur d'interprétation (TALE) a révélé des perspectives supplémentaires pour l'édition précise du génome.17 Les nucléases programmables basées sur TALE peuvent couper n'importe quel groupe d'ADN d'intérêt avec une fréquence modérément élevée. Néanmoins, les difficultés fondamentales des approches de nucléases effectrices de type activateur de traduction (TALEN) sont le plan d'un clonage atomique complexe pour chaque nouvelle cible d'ADN et sa faible productivité de criblage génomique efficacement concentré sur les cellules. Biographie Guido Krupp est le PDG et président d'Amptec GmbH. Il a obtenu son doctorat de l'Université de Würzburg et de l'Institut Max-Planck, Martinsried. Il a fait son post-doctorat à l'Université de Yale. Il est désigné comme chef de groupe de recherche à l'Université de Kiel. Il est le fondateur d'Artus GmbH et d'Amptec GmbH. Ses intérêts de recherche comprennent la technologie des acides nucléiques en mettant l'accent sur l'ARN, les agents pathogènes des plantes (viroïdes), les ribozymes et la télomérase. Il a publié plus de 60 publications et a été désigné comme rédacteur en chef de Ribozyme Biochemistry & Biotechnology, et de Telomeres, Telomerases & Cancer, et membre du comité de rédaction de Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.com9 Dans la phase de développement précoce de la modification du génome, pour initier les DSB idéaux à chaque site cible spécifique de l'ADN, la création de nucléases à doigts de zinc (ZFN)14 ou méganucléases15 distinctes a été le centre de recherche. Ces structures de nucléases nécessitaient une capacité particulière à créer de fausses protéines constituées d'espaces de restriction d'ADN spécifiques à arrangement variable, chacun associé à une nucléase spécifique pour le clivage de la cible, fournissant aux scientifiques des instruments phénoménaux pour effectuer des manipulations génétiques.16 Par la suite, une autre classe de zone réactive de Flavobacterium okeanokoites (FokI) obtenue à partir de protéines bactériennes appelée effecteurs de type activateur d'interprétation (TALE) a révélé des perspectives supplémentaires pour l'édition précise du génome.17 Les nucléases programmables basées sur TALE peuvent couper n'importe quel groupe d'ADN d'intérêt avec une fréquence modérément élevée. Néanmoins, les difficultés fondamentales des approches de nucléases effectrices de type activateur de traduction (TALEN) sont le plan d'un clonage atomique complexe pour chaque nouvelle cible d'ADN et sa faible productivité de criblage génomique efficacement concentré sur les cellules. Biographie Guido Krupp est le PDG et président d'Amptec GmbH. Il a obtenu son doctorat de l'Université de Würzburg et de l'Institut Max-Planck, Martinsried. Il a fait son post-doctorat à l'Université de Yale. Il est désigné comme chef de groupe de recherche à l'Université de Kiel. Il est le fondateur d'Artus GmbH et d'Amptec GmbH. Ses intérêts de recherche comprennent la technologie des acides nucléiques en mettant l'accent sur l'ARN, les agents pathogènes des plantes (viroïdes), les ribozymes et la télomérase. Il a publié plus de 60 publications et a été désigné comme rédacteur en chef de Ribozyme Biochemistry & Biotechnology, et de Telomeres, Telomerases & Cancer, et membre du comité de rédaction de Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.comLes difficultés fondamentales des approches de nucléases effectrices de type activateur de traduction (TALEN) sont le plan d'un clonage atomique complexe pour chaque nouvelle cible d'ADN et sa faible productivité de criblage génomique efficacement focalisé sur les cellules. Biographie Guido Krupp est le PDG et président d'Amptec GmbH. Il a obtenu son doctorat de l'Université de Würzburg et de l'Institut Max-Planck, Martinsried. Il a fait son post-doctorat à l'Université de Yale. Il est désigné comme chef de groupe de recherche à l'Université de Kiel. Il est le fondateur d'Artus GmbH et d'Amptec GmbH. Ses intérêts de recherche comprennent la technologie des acides nucléiques en mettant l'accent sur l'ARN, les agents pathogènes des plantes (viroïdes), les ribozymes et la télomérase. Il a publié plus de 60 publications et a été désigné comme rédacteur en chef de Ribozyme Biochemistry & Biotechnology, et de Telomeres, Telomerases & Cancer, et membre du comité de rédaction de Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.comLes difficultés fondamentales des approches de nucléases effectrices de type activateur de traduction (TALEN) sont le plan d'un clonage atomique complexe pour chaque nouvelle cible d'ADN et sa faible productivité de criblage génomique efficacement focalisé sur les cellules. Biographie Guido Krupp est le PDG et président d'Amptec GmbH. Il a obtenu son doctorat de l'Université de Würzburg et de l'Institut Max-Planck, Martinsried. Il a fait son post-doctorat à l'Université de Yale. Il est désigné comme chef de groupe de recherche à l'Université de Kiel. Il est le fondateur d'Artus GmbH et d'Amptec GmbH. Ses intérêts de recherche comprennent la technologie des acides nucléiques en mettant l'accent sur l'ARN, les agents pathogènes des plantes (viroïdes), les ribozymes et la télomérase. Il a publié plus de 60 publications et a été désigné comme rédacteur en chef de Ribozyme Biochemistry & Biotechnology, et de Telomeres, Telomerases & Cancer, et membre du comité de rédaction de Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.com
English 
Spanish 
Chinese 
Russian 
German 
Japanese 
Portuguese 
Hindi