Abstrait

Biotechnologie-2013 : B-cert : Un programme de formation pour les producteurs de plantes issues du génie génétique - Ronnie W. Heiniger - North Carolina State University

 Ronnie W. Heiniger

 L'introduction de plantes génétiquement modifiées (GM) produisant des protéines à usage pharmaceutique pour améliorer la santé humaine ou réduire les maladies dépend de systèmes de production capables de produire ces plantes génétiquement modifiées dans des conditions contrôlées qui empêchent le déplacement du matériel génétique de la plante cible vers l'environnement. En raison des préoccupations du public concernant la gestion de la biotechnologie aux États-Unis, l'USDA-APHIS a développé le programme Biotechnology Quality Management System (BQMS). Le BQMS est un programme fédéral conçu pour améliorer la gestion des organismes génétiquement modifiés par le biais d'une formation intensive, d'un suivi et d'une surveillance de tous les aspects du processus, du laboratoire au terrain. Le programme BQMS aide les organisations impliquées dans la recherche et le développement en biotechnologie, y compris les petites entreprises et les chercheurs universitaires, à analyser les points de contrôle critiques au sein de leurs systèmes de gestion afin de mieux maintenir la conformité avec les réglementations de l'APHIS (7 CFR partie 340) pour l'importation, le mouvement interétatique et la dissémination sur le terrain d'organismes génétiquement modifiés (GM) réglementés. Malheureusement, le programme BQMS ne s'adresse pas à l'un des liens les plus importants du processus de production : le producteur. Pour corriger cette lacune, la North Carolina State University, en coopération avec le North Carolina Biotechnology Center et la Northeastern Economic Development Corporation, a développé un programme de certification des producteurs appelé B-Cert. Le programme B-Cert rassemble les procédures requises pour empêcher la perte de matériel génétique du site cible, les normes de certification et les exigences établies par l'USDA-APHIS pour la culture de cultures transgéniques afin d'élaborer des lignes directrices et des normes pour la gestion des cultures, les exigences d'isolement, l'assainissement des équipements, les garanties environnementales, les exigences de tenue de registres et d'autres processus critiques. Nous avons exprimé du viscum pleine longueur dans les PCP de N. tabacum et les feuilles de N. benthamiana à des concentrations allant jusqu'à 7 mg/kg de produit purifié. L'expression des chaînes A et B est également devenue possible dans les deux systèmes, mais le rendement du produit hétérodimérique a été réduit jusqu'à 0,97 g/g, tandis que l'expression d'une chaîne seule n'a pas produit de quantités quantifiables de protéines recombinantes. Le rendement de la viscumine à cycle complet est devenu comparable à celui des lectines végétales exprimées dans la levure, mais environ 6 fois inférieur à celui des chaînes A et B de viscumine repliées exprimées dans E. coli. Cependant, le processus bactérien a une faible cicatrisation, nécessite une dilution généralisée et est complexe, tandis que la méthode basée sur la plante n'a couvert que la moitié du nombre d'étapes. Selon une comparaison directe des coûts entre les deux méthodes, le dispositif d'expression végétale est actuellement 50 % moins cher, mais de légères améliorations du rendement peuvent réduire les coûts de production jusqu'à environ 88 %. Par rapport à l'hôte natif V. album, la méthode d'expression hétérologue a réduit le délai de production de plusieurs années,L'expansion du confinement ainsi que le rendement en temps-espace ont facilité les modifications ciblées du produit. Par conséquent, la production de viscumine recombinante dans les plantes est une opportunité bénéfique pour les structures microbiennes et indigènes. Nous avons exprimé de manière transitoire la viscumine à durée complète (visFL), en utilisant l'UTR 5′′ locale et la séquence codante, intégrées dans l'assemblage pTRAc′ visFL. Français Nous avons également exprimé la chaîne a individuelle (visA) en utilisant la construction pTRAc?CHSLPH?visAA?S, ou la chaîne a conjointement avec la chaîne B individuelle (visB) en utilisant la construction pTRAc?CHSLPH?visBA?S dans N. tabacum en utilisant?2 PCP (figure 2a) ou dans les feuilles de fleurs intactes de N. benthamiana (figure 2b) par infiltration avec A. tumefaciens . Les constructions à chaîne unique visA et visB transportaient un peptide signal recombinant pour la sécrétion dans l'apoplaste de la vie végétale intacte ou dans la zone extracellulaire de 2 cellules en suspension pour contourner l'auto-intoxication immédiate de l'hôte respectif. Nous avons détecté une bande d'environ 30 kDa dans tous les échantillons au moyen d'une analyse Western blot 5 jours après l'infiltration (dpi) en utilisant un anticorps monoclonal (mAb) TA-5 de séquence unique. Cette bande a migré légèrement plus lentement que le viscum bactérien non glycosylé dans une chaîne connue (~ 28 kDa). Français Elle correspondait à la longueur attendue de la séquence N-glycosylée de la viscumine a (~30 kDa) qui comprend la masse du polypeptide plus 1,9 kDa représentant un simple N-glycane ajouté à un seul site accepteur attendu en ligne (Chauhan, Rao et Raghava, 2013). Une telle glycosylation était attendue en raison de la concentration vacuolaire (Strasser, 2014) via une séquence signal interne de la toxine vieillie (Frigerio et al., 2001). Le rendement le plus élevé de la séquence viscumine a, par rapport aux autres unités d'infiltration, a été détecté dans les échantillons visFL. Dans les PCP et les feuilles intactes, les rapports visFL:visA + visB:visA pour le rendement de la séquence viscumine a étaient respectivement de 6,8:4,0:1,0 et 35:3,5:1,0. Français dans les échantillons PCP visFL et visA + visB, nous avons également détecté une bande d'environ 65 kDa correspondant à la taille attendue d'un hétérodimère de viscumine N †glycosylé ou d'un homodimère en série, comme mentionné précédemment dans E. coli (Kourmanova et al., 2004). Outre la conception du gène (période complète par rapport aux chaînes séparées), la distinction entre les peptides signal et les 5'-UTR peut également avoir affecté les rendements en série a déterminés pour les trois configurations d'expression (Jansing & Buyel, 2018 ; Meshcheriakova, Saxena et Lomonossoff, 2014). De faibles concentrations absolues de protéines peuvent également avoir évité la détection de dimères dans les échantillons visA. Biographie Ronnie W. Heiniger est professeur au département des sciences des cultures de l'université d'État de Caroline du Nord. Il a obtenu son doctorat. en écologie des cultures de l'Université d'État du Kansas en 1994.Heiniger a travaillé pendant les 15 dernières années comme spécialiste de la recherche et de la vulgarisation au Vernon G. James Research and Extension Center à Plymouth, en Caroline du Nord. Heiniger est connu pour ses recherches appliquées et a publié plus de 30 articles de revues et présenté des communications couvrant son travail sur l'agriculture de précision et la gestion des cultures. Heiniger a reçu le prix Gerold O Mott pour ses recherches exceptionnelles de l'American Society of Agronomy et est membre de l'Academy of Outstanding Extension Specialists de la North Carolina State University.                                                                                                                                                                                                                                                             Ron_Heiniger@ncsu.edu