Abstrait

Biotechnologie-2013 : C-SLGE- Clonage du gène de la lipase de Saccharomyces cerevisiae dans E. coli nissle 1917 (probiotique) - Gadangi Indira - Université de Kakatiya

 Indira Gadangi

 Les enzymes lipases peuvent augmenter la valeur nutritionnelle des aliments et jouer un rôle crucial dans la digestion, le transport et le traitement des lipides nutritionnels (par exemple, les triglycérides, les graisses, les huiles) dans la plupart, voire la totalité, des organismes vivants. Escherichia coli Nissle 1917 est un micro-organisme probiotique formant des spores. Dans cette étude, nous avons cherché à cloner et à expliciter le gène de la lipase dans E. coli Nissle 1917 pour créer de meilleurs probiotiques. Le gène de la lipase de Saccharomyces cerevisiae a été cloné et inséré dans le vecteur pUC18, puis transféré dans E. coli par transformation. L'analyse par insertion et PCR de pUC18 provenant d'E. coli Nissle 1917 recombinant a montré que le fragment du gène de la lipase sur électrophorèse sur gel d'agarose était d'environ 1,4 kb. Le gène de la lipase cloné dans E. coli Nissle 1917 a confirmé l'activité de l'enzyme lipase lorsqu'il était cultivé sur un milieu supplémenté en lipides. L'activité lipasique de la bactérie E.coli Nissle 1917 recombinante a été étudiée sur des plaques d'essai à différents pH (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) pour obtenir une conversion de pH supérieure à celle de l'enzyme dans le nouvel hôte et l'activité lipasique a été déterminée davantage sur les plaques de pH acide que sur les plaques de pH normal et de pH élevé qui s'est avéré être de 6. Le vecteur choisi pour la création de la bibliothèque de levures était le plasmide hybride YCp5O (Fig. 1). YCp5O comprend le point de départ de réplication de pBR322 et les gènes pour Ampr et Tetr. L'insertion dans le site BamHI de YCp5O rend le plasmide Tets. YCp5O comprend également un réplicateur de levure, ARSI, et un marqueur sélectionnable dans la levure, URA3. Par conséquent, le plasmide comprend le fragment de levure CEN4 de 1,8 kb qui englobe le centromère du chromosome IV. Nous avons choisi d'utiliser le plasmide contenant le centromère car les fréquences de transformation et la stabilité des transformants obtenus sont plus élevées qu'avec les vecteurs contenant ARS ou 2-,um. Cela a pour résultat important que chacune des quelques modifications de la levure nécessaires à la séparation et à la caractérisation des gènes est améliorée d'au moins un jour. De plus, au départ, nous ne savions pas si le gène CDC8 pouvait être mortel à forte dose de gène. YCp5O a un nombre de doublons de 1. La bibliothèque a été construite au moyen d'une modification mineure de la procédure de Nasmyth et Reed (21), comme décrit ci-dessous. Comme le pool contenait au moins 1,7 x 104 clones recombinants, il y a environ six génomes de levure dans cette bibliothèque. Isolement des plasmides contenant CDC8. Lorsqu'il a été utilisé pour convertir CLK6 ura3 cdc8, l'ADN organisé à partir du pool hybride de levure YCp5O a donné environ 103 transformants URA+ selon ug, dont 0,04 % ont pu se développer à la température non permissive (37°C). L'ADN a été organisé à partir de 4 des transformants URA' CDC' de levure et délivré à E. coli via la transformation en résistance à l'ampicilline. L'ADN plasmidique a été préparé à partir des transformants Ampr et analysé par digestion avec une endonucléase de restriction observée au moyen d'une électrophorèse sur gel d'agarose.Comme les quatre plasmides avaient tous des cartes enzymatiques restrictives égales, le seul, Y, nous avons cloné un gène qui améliore les mutants cdc8 et qui est physiquement lié au locus SUP4. La position de la carte du gène cloné confirme son identité avec le gène CDC8. La bibliothèque que nous avons décrite ici devrait également être utile pour cloner des gènes qui seraient mortels à forte dose ; la transformation à haute fréquence est effectuée avec le vecteur centromère ; cependant, la variété de réplication intracellulaire est de 1. Une découverte intéressante est que le fragment minimal capable de compléter la mutation cdc8 est long de 750 pb. étant donné que les plasmides contenant ce petit insert étaient capables de se remodeler avec la même fréquence élevée que les plasmides contenant CDC8. Le plasmide pSU4 a été clivé avec la nucléase limite BamHI, et le fragment contenant les gènes SUP4 et CDC8 a été recloné dans le plasmide YCp5O. YCp5O a été digéré avec l'endonucléase BamHI et traité avec la phosphatase alcaline pour éviter la ligature de l'ADN vecteur en l'absence d'insert. Les ligatures ont été effectuées en une seule journée à 15 °C, en utilisant l'ADN ligase T4; l'agrégat de réponse contenait 1 µg d'ADN vecteur et 0,5 µg de pSU4 dans 50 µl de 66 mM de Tris-chlorhydrate (pH 7,6)-66 mM de MgCl2-10 mM de dithiothréitol-1 mM d'ATP. Le plasmide résultant, YCp5O-S4 CDC8, s'est avéré contenir des sites BamHI, et l'orientation du fragment inséré a été déterminée à l'aide d'une analyse de digestion par endonucléase de restriction. Comme il existe de gros segments d'ADN flanquants, il semble probable que ce fragment contienne le gène CDC8 complet. Cependant, une telle région codante ne peut généralement donner qu'une protéine de 27 000 daltons. En utilisant des tests de complémentation, d'autres ont purifié la protéine CDC8 jusqu'à homogénéité et ont découvert un poids moléculaire monomérique de 34 000 à 40 000 (1). Il est donc possible que nous ayons identifié un fragment de la protéine CDC8 qui est actif soit en lui-même, soit en complémentant la protéine sensible à la température dans le mutant. (La possibilité que le petit fragment du gène donne des transformants à 370 °C grâce à une caractéristique distinctive de recombinaison entre le plasmide et le gène mutant au lieu de la complémentation est rendue peu probable par la fréquence élevée de transformation et par le fait que les cellules qui ont séparé le phénotype URA+ après croissance sur milieu riche sont à nouveau sensibles à la température et que cette ségrégation se produit avec la fréquence caractéristique de la perte autosuffisante de plasmide par opposition à l'absence de plasmides inclus.) Le séquençage nucléotidique du petit fragment et la purification du produit du gène CDC8 surproduit à partir de cellules contenant le plasmide CDC8 devraient résoudre ces questions. Biographie Gadangi Indira a terminé son doctorat sur une étude approfondie de la dermatophytose du district de Warangal, AP de l'Université de Kakatiya et travaille actuellement sur un projet de recherche majeur financé par l'UGC.Elle est responsable du département de microbiologie du Pingle Govt UG et PG College à Warangal. Elle a publié plus de 15 articles dans des revues réputées, des actes de séminaires nationaux et internationaux. gadangi.indira@gmail.com