Abstrait

Biotechnologie-2013 : Culture d'embryons ovins, caprins et bovins de différents niveaux de qualité en TCM-199 et BAF dans un incubateur à 5% de CO2 - Daniel M Barry - Université de Venda

 Daniel M Barry

Après l'échantillonnage des organismes initiaux d'animaux domestiques livrés in vivo, ils sont généralement évalués sous une amplification élevée (au moins 80X) à l'aide d'une lentille grossissante transformée ou sonore. Les organismes initiaux de grade 1 donneront les meilleurs résultats d'origine lorsqu'ils seront transférés vers des femelles bénéficiaires, tandis que les organismes initiaux de grade 3 donneront les résultats les plus médiocres. Le but de l'étude actuelle était de cultiver chacune des trois évaluations de qualité des organismes initiaux pré-compactés au stade morula livrés in vivo de moutons, de chèvres et d'animaux laitiers dans deux milieux de culture distincts, puis d'évaluer le développement des organismes initiaux en évaluant la quantité d'organismes initiaux atteignant le stade blastocyste produit. Français Les résultats ont indiqué qu'il n'y avait pas de différences critiques entre l'amélioration des organismes non développés de grade 1 et de grade 2 de l'une des trois espèces lorsqu'ils étaient raffinés dans du TCM-199 ou dans du liquide amniotique de type bœuf (BAF) inactivé par la chaleur au stade précoce de la gestation (< 60 j) comme milieux de culture. Fondamentalement, plus d'organismes naissants pré-compactés de grade 3 de mouton, de chèvre et de bovin au stade morula, dans tous les cas, créés au stade de blastocyste incubé lorsqu'ils sont raffinés dans du BAF avec 10 % de FBS et des agents anti-infectieux, par rapport à la culture dans du TCM-199 avec 10 % de FBS et des antimicrobiens (p<0,05). Matériel et méthodes Culture cellulaire : Les OLG ont été détachés des cerveaux de moutons âgés de 4 à 6 ans comme décrit précédemment. Les cellules nouvellement confinées, bande III (voir Szuchet et al., 1980, pour les subtilités) ont été plaquées sur des plaques de culture en plastique à 2 x 106 cellules/ml. Environ 40 % des cellules sont attachées à la plaque ; le reste des cellules formait de petits groupes d'écumage. Ces dernières sont appelées B3.f OLG (Szuchet et Yim, 1984). Après 4 à 5 jours, le surnageant contenant B3.f OLG a été recueilli et centrifugé. Les cellules du culot ont été remises en suspension dans du milieu de culture et replacées dans des boîtes de Petri recouvertes de polylysine sur la surface desquelles l'OLG s'est attaché. Les dernières cellules sont appelées B3 fA (A pour suiveur). B3. Les cellules OLG ont été maintenues dans le milieu Eagles modifié de Dulbecco amélioré avec 20 % de sérum de poney, 2 mM de glutamine et une antitoxine (0,3 kg/ml d'amphotéricine B et 2,4 g/ml de garamycine). Les cultures ont été traitées deux fois par semaine. L'impeccabilité de la culture a été déterminée à 98-99 % en utilisant une réponse immunitaire monoclonale contre le galactocérébroside (une bénédiction du Dr B. Ranscht), ainsi qu'une réponse immunitaire polyclonale contre la 2',3'-nucléotide cyclique 3'-phosphohydrolase (une bénédiction du Dr T. Sprinkle). Les cellules ont été testées 2 à 4 jours après la connexion. Les flux de cellules entières Les battements de tension positifs du potentiel de maintien (- 80 mV) ont déclenché un courant sortant subordonné à la tension et au temps dans les OLG raffinés. Les enregistrements de tension-fermeture de cellules entières d'une OLG après 4 jours en culture de disciples peuvent être trouvés dans la figure 2.La partie transitoire du courant a été inactivée à la capacité de maintien dépolarisée de - 40 mV, laissant un segment d'état constant de suffisance variable (Fig. 2B). La figure 2C montre la relation courant-tension de pointe pour les flux décrits dans la figure 2, A et B. Dans l'ensemble, la relation courant-tension pour le courant transitoire ou de pointe est restée constante avec le temps après la fondation de l'ensemble de la structure cellulaire, ce qui permet un ajustement initial de 3 à 5 minutes. La sélectivité ionique de la partie transitoire du courant sortant a été résolue à partir de l'inversion des flux de queue dans la ligne de mire de 5,4 mM en dehors de K+. Le potentiel du film a d'abord été modifié à 120 mV pendant 10 ms (Fig. 3A) puis ramené à différentes possibilités de test. La relation courant-tension momentanée (5 ms après le début des flux de queue) montre que le potentiel d'inversion était de - 66,2 f 1,45 mV (4). Le potentiel d'inversion déterminé pour les canaux parfaitement spécifiques à K+ est de - 82 mV. L'extension de [K], de 5,4 à 35 mM K+, a fait passer le potentiel d'inversion à - 19,8 mV (2), Les preuves à l'appui des perceptions selon lesquelles le courant sortant commandé par la tension est constitué de plusieurs conductances proviennent des études des flux OLG à divers moments en culture. Dans les 48 heures suivant le placage, B3.fA OLG a commencé à créer des procédures et à exprimer des flux sortants voltage-dépendants. Après plusieurs semaines en culture, le segment transitoire du courant sortant semblait diminuer. Cette diminution était souvent accompagnée d'une augmentation de l'état constant ou du segment non inactivant du courant sortant. De plus, il y avait une augmentation du courant redresseur interne comme le montre la figure 9. Dans une série de 85 examens, nous avons constaté que 88 % (30/34) des cellules avec des formes après le jour 7 de la culture suiveuse ont développé un redresseur interne contrasté et 18 % (5/28) des cellules aux jours 1-3 et 26 % (6/23) aux jours 4-7. La différence dans la fréquence du redresseur interne dans les cellules avant le jour 7 et après le jour 7 dans la culture suiveuse était exceptionnellement grande (p < 0,001 comme contrôlé par l'analyse x2). Curieusement, 57 % (4/7) de ces quelques cellules restées sans formes après quatorze jours de culture présentaient des films à haute obstruction directe. Les propriétés électrophysiologiques des OLG ont été examinées avec la configuration cellulaire complète de la stratégie de voltage-clamp à anode fixe. Les analyses de cette étude montrent la présence d'un courant extérieur subordonné au voltage et d'un courant redresseur interne qui sont spécifiques au K+. Le courant sortant dépendant de la tension parle probablement d'une réaction composite de deux conductances distinctes. Cela semble différent par rapport aux rapports de Bevan et Raff (1985) et Bevan et al. (1986), qui n'ont pas découvert de conductances subordonnées à la tension dans les OLG. Kettenmann et al. (1984a) ont observé une légère dépendance à la tension dans leurs recherches monocanal sur les OLG (le changement normal de PO était de 0,08 f 0,04 par pas de 10 mV).Nous n'avons pas pu démontrer le rôle de Caz+ dans l'initiation des flux de K+ puisque (1) le bloqueur du courant calcique cadmium n'avait aucun impact (Brown et Griffith, 1983 ; Galvan et Sedlmeir, 1984 ; Beluzzi et al., 1985b).daniel.barry@univen.ac.za