Fatemeh Davam Pasteur
Résumé : Aujourd'hui, près de 60 à 70 % des protéines recombinantes sont correctement produites dans les cellules CHO. L'optimisation des conditions de sous-culture cellulaire pour la croissance et la productivité des cellules recombinantes d'ovaire de hamster chinois (CHO) est une étape essentielle de la fabrication biopharmaceutique. L'expression brève de la protéine (expression génique temporaire) TGE est le moyen privilégié pour exprimer des protéines recombinantes dans un court laps de temps et à une échelle appropriée pour les tests pré-médicaux. Dans la présente étude, l'impact de l'optimisation des conditions de transfection dans un milieu sans sérum CD DG44 dans un incubateur à agitation avec des cellules CHO DG44 en situation de suspension a été évalué. Une gamme de valeurs pour l'ADN, le PEI et la sensibilité cellulaire ont été étudiées pour trouver les valeurs supérieures concernant l'efficacité de la transfection. Français Les effets ont confirmé que les valeurs optimisées étaient de 1,5 μg/106 cellules de réactif de transfection (PEI), 0,5*106 cellules pour les densités cellulaires de départ et 2 μg/106 cellules d'ADN avec des performances de transfection respectivement de 28,71, 38,68 et 52,8 %. De plus, sur la base de ces conditions optimisées TGE, l'effet de l'alimentation avec 6 peptones exclusives de soja et de caséine sur les performances de transfection a été évalué. Les résultats de l'alimentation en peptones avec des peptones Caseine Tryptone N1, Soy Peptone A2Sc et Soy Peptone E110 ont montré une efficacité de transfection de 59,88 %, 58,28 % et 68,66 % avec une croissance de 15,44, 12,35 et 28,55 % par rapport au processus optimisé précédent. Ces faits indiquent que la meilleure approche d'alimentation est capable d'augmenter les performances de transfection et constitue une approche prometteuse pour optimiser le processus TGE. Au cours de la dernière décennie, la TGE a été une méthode largement utilisée pour la production rapide de protéines recombinantes dans les cellules de mammifères. Malgré diverses recherches effectuées pour améliorer cette technologie en termes d'évolutivité et de productivité, les meilleurs rendements de production de TGE restent généralement inférieurs aux valeurs obtenues avec des souches cellulaires stables. Compte tenu du rôle important des cellules CHO en tant qu'hôte le plus courant pour la production de protéines de guérison, il est préférable d'avoir une approche TGE optimisée pour la production d'une quantité suffisante de protéines recombinantes pour les recherches précliniques. De cette manière, il n'est pas essentiel pour les groupes biopharmaceutiques de remplacer leur lignée cellulaire source préclinique de protéines recombinantes par une autre lignée cellulaire transfectée de manière stable pour le produit final. Les performances de transfection sont l'un des facteurs importants affectant les résultats de la TGE. L'optimisation de la quantité de réactif de transfection PEI, des densités cellulaires initiales et du plasmide ADN s'est avérée avoir d'excellents résultats sur les efficacités de transfection. Cependant, en général, les études d'optimisation ont été réalisées sur la lignée cellulaire HEK (avec de meilleurs taux de transfection) et les quelques études sur la lignée cellulaire CHO n'ont pas encore réussi à atteindre des valeurs aussi élevées que les cellules HEK.L'état optimisé dépend également de la taille et des caractéristiques du plasmide d'ADN et de sa compatibilité avec la lignée cellulaire, il est donc essentiel de mettre en place une méthode TGE optimisée pour chaque protéine recombinante cible. La densité cellulaire élevée utilisée au cours de la transfection augmente la possibilité d'exposition cellulaire aux polyplexes PEI-ADN, et dans les situations hypothermiques de la vie, les cellules persisteraient dans des déplétions nutritionnelles car elles sont bloquées dans une phase G1 avec moins de demande en vitamines. L'expression génique temporaire (TGE) est une technologie bien installée pour la production rapide de quantités de milligrammes à grammes de protéines recombinantes dans les lignées cellulaires de rein embryonnaire humain (HEK) et d'ovaire de hamster chinois (CHO) (1-3). En raison du faible taux de rotation et du prix du café, la plate-forme TGE joue un rôle plus important dans les niveaux de développement précoce biopharmaceutique pour deux raisons ; tout d'abord, il est essentiel pour les grandes sociétés biopharmaceutiques de présenter plus d'un candidat médicament avant de passer au pipeline de développement formel. En pensant au fait que les cellules CHO sont les hôtes dominants pour la production de protéines recombinantes dans les entreprises biopharmaceutiques de pointe, il serait utile d'optimiser la technique TGE pour cette lignée cellulaire afin de pouvoir extrapoler les enregistrements pour le développement de lignées cellulaires stables. En raison des nombreux risques associés à l'utilisation du sérum dans les cultures cellulaires, les bioprocédés industriels sont désormais essentiellement basés sur des milieux sans sérum (SFM) et plus généralement sur des milieux sans additifs animaux, qui présentent à la fois des avantages économiques et de sécurité par rapport aux produits d'origine animale. La nécessité de limiter les additifs d'origine animale dans le processus de fabrication a créé un intérêt pour l'utilisation d'hydrolysats de protéines (peptones) comme suppléments d'opportunité pour renouveler le sérum. Les peptones sont des hydrolysats de protéines hydrosolubles de nature non chimiquement décrite, contenant des peptides, des acides aminés et des sels inorganiques, mais sans lipides ni sucres. (onze) Cette catégorie de composants de milieux sont des vitamines de faible valeur et à forte vente pour la culture cellulaire animale approfondie qui fournissent des vitamines ou augmentent les analogues de produits en fonction du degré d'hydrolyse (2, 12). Diverses peptones sont disponibles dans le commerce, notamment le digestat de tissus de bœuf, de viande, de caséine, de lactalbumine et de levure. Le principal inconvénient de la plupart de ces peptones est leur origine animale qui met en danger la biosécurité du milieu. Il a été démontré que la supplémentation des milieux préférés sans protéines avec des peptones provoque une forte augmentation de la productivité de TGE dans les cellules HEK 293-EBNA (13, 14). Cet effet a également été étudié dans les souches cellulaires solides CHO (15, 16). Cependant, à notre connaissance, aucune étude n'a encore été réalisée pour étudier l'effet des suppléments de peptone sur les cellules CHO dans l'expression temporaire de protéines recombinantes. dans cette étude,Des efforts ont été faits pour sélectionner la meilleure situation TGE concernant le PEI, la sensibilisation à l'ADN et la densité cellulaire. De plus, une stratégie d'alimentation a été appliquée pour la lignée cellulaire recombinante CHO DG44 afin de produire une forme tronquée chimérique unique d'activateur de plasminogène tissulaire. Malgré les rendements TGE améliorés décrits dans l'article, il convient également de mentionner que le passage régulier de la culture cellulaire et le traitement propre de la solution mère PEI devraient jouer un rôle crucial dans l'obtention d'efficacités de transfection élevées et de titres de protéines recombinantes. De plus, il existe encore des goulots d'étranglement, notamment la nécessité d'un échange de milieux pendant la transfection ou d'une sensibilisation cellulaire avant la transfection, qui doivent être pris en compte afin d'en faire une approche à grande échelle réalisable. f.davami@gmail.com
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