Abstrait

En chimie organique 2018 : Outils chimiques pour sonder l'ubiquitination des protéines - Jun Yin

 Jun Yin Professeur associé, Georgia State University, États-Unis

 L'ubiquitine (UB) est transférée par une cascade enzymatique E1-E2-E3 aux protéines substrats pour réguler leur stabilité et leurs fonctions biologiques dans la cellule. Le génome humain code 2 E1, 45 E2 et plus de 600 E3. Ensemble, ils assemblent un réseau complexe de transfert d'UB pour la modification des protéines cellulaires. Actuellement, des questions clés restent sans réponse sur la façon d'identifier les cibles d'ubiquitination des E3 importantes pour les cartographier sur les réseaux de signalisation cellulaire, et sur la façon dont les chaînes d'UB de liaisons spécifiques sont assemblées pour coder des signaux uniques dans la cellule. Nous avons développé une méthode que nous appelons « transfert UB oeorthogonal » (OUT) pour démêler la complexité des réseaux d'ubiquitination des protéines. La clé de l'OUT est de concevoir une cascade d'enzymes E1, E2 et E3 modifiées (xE1, xE2 et xE3) qui transfèrent exclusivement un UB modifié (xUB) aux substrats d'un xE3. Nous exprimons xUB et la cascade OUT dans la cellule, purifions les protéines conjuguées à xUB et révélons leurs identités par protéomique. Les protéines du criblage OUT sont les substrats potentiels de l'E3 dans la cascade OUT. Nous avons développé des cascades OUT avec HECT E3 E6AP et U-box E3s E4B et CHIP et identifié de nouveaux circuits cellulaires régulés par ces E3. Pour étudier le mécanisme de synthèse de la chaîne UB catalysée par E2, nous avons généré des conjugués di-UB spécifiques de liaison par incorporation d'acides aminés non naturels et par ligature de protéines exprimées. Les conjugués di-UB imitent les modes de liaison des UB donneurs et accepteurs au site actif E2 pour la synthèse de la chaîne UB. En caractérisant la structure des conjugués E2-diUB, nous allons révéler comment E2 régule la synthèse des chaînes UB de différentes liaisons. L'ubiquitine (Ub) est une petite protéine régulatrice (8,6 kDa) de 76 acides aminés qui adopte un repliement β-agrippant. Ub est très conservée dans les organismes eucaryotes. La conjugaison de l'ubiquitine à une protéine cible est appelée ubiquitination ou ubiquitylation.1 En général, Ub est attachée aux protéines par une liaison isopeptidique entre le carboxylate C-terminal de l'ubiquitine (glycine 76) et un groupe ε-amino d'un résidu de lysine dans les protéines acceptrices. L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle (MPT) cruciale et réversible dans les cellules eucaryotes. Depuis sa découverte à la fin des années 1970 et au début des années 1980, la modification par l'ubiquitine est apparue comme un mécanisme de régulation important dans la plupart des processus cellulaires chez les eucaryotes. L'ubiquitination affecte les protéines du substrat de nombreuses manières différentes, notamment la signalisation, la dégradation protéasomique, la modification de la localisation cellulaire, la modulation de l'activité catalytique et la promotion ou la prévention des interactions protéiques.2, 3 Les processus cellulaires régulés par l'ubiquitination comprennent le cycle cellulaire, la transcription, le trafic, l'inflammation et la réparation de l'ADN. Notamment, de nombreux processus sont indépendants de la dégradation des protéines médiée par le protéasome. L'ubiquitination implique trois étapes enzymatiques principales catalysées par des enzymes activant l'ubiquitine (E1), des enzymes conjuguant l'ubiquitine (E2),et les ligases d'ubiquitine (E3) (voir Fig. 1).5 Tout d'abord, l'ubiquitine est activée au cours d'une réaction en deux étapes par une E1 (enzyme activant l'ubiquitine) avec consommation d'ATP, formant un intermédiaire adénylate d'ubiquitine puis une liaison thioester entre le carboxyle C-terminal de l'ubiquitine et donc le site cystéine de E1.Le génome humain contient deux E1, à savoir UBA1 et UBA6.8 E2 catalyse le transfert d'Ub du conjugué Ub-E1 au site cystéine de E2 et forme le conjugué Ub-E2 par une réaction de transthioestérification. Le génome humain possède pas moins de 30 enzymes E2 différentes. L'ubiquitine ligase E3 catalyse l'étape ultime de la cascade d'ubiquitination en transférant Ub du conjugué Ub-E2 à la protéine substrat. Les E3 ont une spécificité de substrat pour les enzymes E2. Les ligases cullin-RING, qui constituent le groupe le plus important d'E3 (environ 600 membres), ne forment pas de liaison chimique avec Ub. Deux groupes plus petits d'E3, les ligases HECT (environ 30 membres) et les ligases RBR (environ 12 membres), forment un intermédiaire Ub-thioester avec la cystéine du site E3